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核黃素(維生素B2)熒光光度定量測定法

發(fā)布時(shí)間: 2022-04-07  點(diǎn)擊次數(shù): 6101次

 一、目的

       1.了解熒光法測定核黃素的原理和方法

       2.學(xué)習(xí)熒光光度計(jì)的操作和使用

       3.掌握熒光定量分析工作曲線

二、原理

       核黃素(維生素B2)是一種異咯嗪衍生物,其水及乙醇的中性溶液為黃色,并且有很強(qiáng)的熒光,這種熒光在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中易被破壞。核黃素可被亞硫酸鹽還原成無色的二氫化物,同時(shí)失去熒光,因而樣品的熒光背景可以被測定。二氫化物在空氣中易重新氧化,恢復(fù)其熒光,

三、實(shí)驗(yàn)器材

       1.核黃素片(5mg/片)

       2.熒光光度計(jì)

       3.容量瓶100ml(*2)

       4.試管1.5cm*15cm(*7)

       5.吸管10.0ml(*1),5.0ml(*1),2.0ml(*1),0.50ml(*2)

       6.量筒1000ml(*1),100ml(*1)

四、實(shí)驗(yàn)試劑

       1.核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取核黃素10mg,放入預(yù)先裝有約50ml蒸餾水的1000ml容量瓶中,加入 5ml 6mol/ L 乙酸,再加入大約800ml水,置水浴中避光加熱直至溶解,冷卻至室溫,用蒸餾水定容至1000ml,混勻。

       2.連二亞硫酸鈉(保險(xiǎn)粉)或亞硫酸鈉。

       3.  36%乙酸。

五、操作

    1.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

       將配好的10ug/ ml 標(biāo)準(zhǔn)核黃素溶液,按表50所示比例稀釋成六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    2.樣品溶液的配制

       將被測的樣品(如核黃素藥片、維生素 B 針劑等)參照標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量范圍和溶劑體系配制成測定溶液。對于食物和生物材料中的核黃素測定,一定需要事先經(jīng)過抽提,或經(jīng)過分離,純化處理。

    3.熒光測定

       參照附錄六中熒光光度計(jì)的使用說明,選用濾色片,核黃素?zé)晒鉁y定的激發(fā)光波長為460nm,發(fā)射光波長為520nm。因此可選用帶迪型400nm(藍(lán)色)濾色片為激發(fā)光濾色片,選用截止型510nm(紅色)濾色片為發(fā)射光濾色片。待儀器預(yù)熱并調(diào)好零點(diǎn)后,用0號標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.5ug/ ml )作為參比溶液調(diào)熒光光度計(jì)的熒光強(qiáng)度讀數(shù)到滿刻度(100%),分別測定其他標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的相對熒光強(qiáng)度,在測定中如果樣品溶液的熒光強(qiáng)度超出100%則需要再行稀釋,在每一個(gè)測定溶液測定完后,需要重新倒回到相應(yīng)的試管內(nèi)。

    4,  數(shù)據(jù)處理

       每一個(gè)測定溶液的熒光強(qiáng)度讀數(shù)矯正公式為:F=F1+F2

       式中 F:校正后的熒光強(qiáng)度;

               F1:未還原時(shí)測得的熒光強(qiáng)度:

               F2:還原后測得的熒光強(qiáng)度。

       以標(biāo)準(zhǔn)溶液校正后的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),相應(yīng)的含量為橫坐標(biāo),作出核黃素測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品溶液校正后的熒光強(qiáng)度在工作曲線上查出相應(yīng)的含量。

六、注意事項(xiàng)

       在所有操作過程中,要避免核黃素受陽光直接照射。


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